Кристаллизация белков и установление их структур являются одними из самых перспективных направлений современной биологии. В их основе лежит свойство биомолекул образовывать кристаллы, способныe рассеивать рентгеновские лучи. 3акон Брэгга, описывающий зависимость между углами и фазами падающих и отраженных волн и расстояниями между атомами в кристаллической решетке, позволяет воссоздать трехмерную кристаллическую структуру по картине дифракции кристаллами рентгеновских лучей.
В настоящее время сотни лабораторий в самых разных странах мира занимаются либо исключительно кристаллизацией и установлением структур белков, либо используют этот процесс в качестве дополнения и доказательства правильности тех или иных теорий и моделей, основанных на биохимических данных. Сотни структур публикуются каждый год в самых престижных биологических журналах мира, пополняя компьютерную базу данных GenBank. Эта цифра продолжает расти из года в год. К 1971 году было известно только 7 структур. За последние несколько лет это направление значительно прогрессировало и к 2003 году в базе данных www.pdb.ru насчитывалось более 20000 кристаллических структур молекул белков.
Несмотря на значительный прогресс последних лет, кристаллография остается весьма трудоемким процессом, в котором многое зависит от простой удачи. Универсальных правил и гарантий получения кристаллов, которые будут достаточно хорошо рассеивать проходящие через них рентгеновские лучи, на настоящий момент не существует. Обычно процесс получения третичной структуры белка может занимать, в зависимости от опытности кристаллографа, интенсивности работы и других факторов, от нескольких месяцев до пары лет.
Кристаллизация белков используется:
а) как завершающая стадия очистки,
б) для доказательства гомогенности белка,
в) как метод стабилизации при хранении (многие фирмы продают чистые ферменты в виде суспензии кристаллов, помещенных в раствор сульфата аммония),
г) для определения третичной структуры белков методом рентгеноструктурного анализа.
Кристаллы растут из пересыщенных растворов вследствие агрегации высокоупорядоченным образом. Выращивание кристаллов занимает много времени, особенно чтобы получить более крупные кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Чаще всего в таблице, отражающей ход очистки белка, кристаллизация представлена в качестве последнего этапа. Это указывает на то, что фермент получен в достаточно чистом состоянии, и такой кристаллический препарат пригоден для длительного хранения. Но кристаллы могут образовываться и в очень разнородных смесях белков. Если примеси не находятся в перенасыщенном состоянии, то агрегировать будет тот белок, который присутствует в этом состоянии, и могут образоваться его кристаллы.
Например, метод очистки кроличьей альдолазы заключался в том, что к мышечному экстракту добавляли сульфат аммония до 50% насыщения, осадок удаляли. В надосадочной жидкости альдолаза составляла около 15% от всех белков. При увеличении концентрации сульфата аммония до 52% насыщения альдолаза начинала медленно кристаллизоваться. Отсюда следует, что само образование кристаллов фермента не может служить доказательством того, что раствор, из которого он выпал, содержит чистый фермент.
Методы кристаллизации
Чтобы началась кристаллизация, необходимо создать такие условия, в которых белковый раствор становится перенасыщенным, что приводит к белок-белковой агрегации. Для этой цели используют осадители (вещества, уменьшающие растворимость): сульфат аммония, полиэтиленгликоль, органические растворители. Обычно требуется тщательное изучение условий кристаллизации конкретного белка: рН, концентрации буфера и осадителя, ионов металлов.
Используют следующие приемы:
1. равновесный диализ против осадителя,
2. диффузия паров летучих веществ (методы «висящей и «сидящей» капли).
Рис. Метод «висящей капли»
Осадитель помещают на дно стаканчика, капля концентрированного раствора белка находится на внутренней стороне стеклышка, закрывающего этот стакан. За счет диффузии паров происходит медленное возрастание концентрации осаждающего вещества в капле раствора белка. Раствор белка может также содержать следы ионов металлов. Например, известно, что для кристаллизации инсулина необходимы ионы цинка.
Рис. Метод «сидящей капли»
В этом методе раствор белка помещают на пьедестал, возвышающийся над резервуаром с осадителем.
Рис. «Сэндвич» метод
3. метод свободной диффузии
Концентрированные растворы белка и осадителя наслаиваются, идет диффузия. В отличие от метода 2 происходит быстрое пересыщение белкового раствора и образование центров кристаллизации. При дальнейшей диффузии идет понижение концентрации белка и осадителя.
Очень важна скорость образования зародышей кристаллов, которая зависит от концентрации белка, а чем меньше кристаллов, тем больше их размер. Скорость же роста кристаллов зависит от растворимости белка, т.е. от концентрации растворителя. Иногда чтобы вырастить большие кристаллы, в раствор белка вносят затравку – мелкие кристаллы этого белка.
Кристалл белка может храниться полгода в специальном растворе, который не содержит белка. Подбирается такая концентрация осадителя, при которой кристалл не растворялся бы и не трескался. Кроме того, в раствор добавляют азид натрия или толуол против бактериального заражения.
В настоящее время сотни лабораторий в самых разных странах мира занимаются либо исключительно кристаллизацией и установлением структур белков, либо используют этот процесс в качестве дополнения и доказательства правильности тех или иных теорий и моделей, основанных на биохимических данных. Сотни структур публикуются каждый год в самых престижных биологических журналах мира, пополняя компьютерную базу данных GenBank. Эта цифра продолжает расти из года в год. К 1971 году было известно только 7 структур. За последние несколько лет это направление значительно прогрессировало и к 2003 году в базе данных www.pdb.ru насчитывалось более 20000 кристаллических структур молекул белков.
Несмотря на значительный прогресс последних лет, кристаллография остается весьма трудоемким процессом, в котором многое зависит от простой удачи. Универсальных правил и гарантий получения кристаллов, которые будут достаточно хорошо рассеивать проходящие через них рентгеновские лучи, на настоящий момент не существует. Обычно процесс получения третичной структуры белка может занимать, в зависимости от опытности кристаллографа, интенсивности работы и других факторов, от нескольких месяцев до пары лет.
Кристаллизация белков используется:
а) как завершающая стадия очистки,
б) для доказательства гомогенности белка,
в) как метод стабилизации при хранении (многие фирмы продают чистые ферменты в виде суспензии кристаллов, помещенных в раствор сульфата аммония),
г) для определения третичной структуры белков методом рентгеноструктурного анализа.
Кристаллы растут из пересыщенных растворов вследствие агрегации высокоупорядоченным образом. Выращивание кристаллов занимает много времени, особенно чтобы получить более крупные кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Чаще всего в таблице, отражающей ход очистки белка, кристаллизация представлена в качестве последнего этапа. Это указывает на то, что фермент получен в достаточно чистом состоянии, и такой кристаллический препарат пригоден для длительного хранения. Но кристаллы могут образовываться и в очень разнородных смесях белков. Если примеси не находятся в перенасыщенном состоянии, то агрегировать будет тот белок, который присутствует в этом состоянии, и могут образоваться его кристаллы.
Например, метод очистки кроличьей альдолазы заключался в том, что к мышечному экстракту добавляли сульфат аммония до 50% насыщения, осадок удаляли. В надосадочной жидкости альдолаза составляла около 15% от всех белков. При увеличении концентрации сульфата аммония до 52% насыщения альдолаза начинала медленно кристаллизоваться. Отсюда следует, что само образование кристаллов фермента не может служить доказательством того, что раствор, из которого он выпал, содержит чистый фермент.
Методы кристаллизации
Чтобы началась кристаллизация, необходимо создать такие условия, в которых белковый раствор становится перенасыщенным, что приводит к белок-белковой агрегации. Для этой цели используют осадители (вещества, уменьшающие растворимость): сульфат аммония, полиэтиленгликоль, органические растворители. Обычно требуется тщательное изучение условий кристаллизации конкретного белка: рН, концентрации буфера и осадителя, ионов металлов.
Используют следующие приемы:
1. равновесный диализ против осадителя,
2. диффузия паров летучих веществ (методы «висящей и «сидящей» капли).
Рис. Метод «висящей капли»
Осадитель помещают на дно стаканчика, капля концентрированного раствора белка находится на внутренней стороне стеклышка, закрывающего этот стакан. За счет диффузии паров происходит медленное возрастание концентрации осаждающего вещества в капле раствора белка. Раствор белка может также содержать следы ионов металлов. Например, известно, что для кристаллизации инсулина необходимы ионы цинка.
Рис. Метод «сидящей капли»
В этом методе раствор белка помещают на пьедестал, возвышающийся над резервуаром с осадителем.
Рис. «Сэндвич» метод
3. метод свободной диффузии
Концентрированные растворы белка и осадителя наслаиваются, идет диффузия. В отличие от метода 2 происходит быстрое пересыщение белкового раствора и образование центров кристаллизации. При дальнейшей диффузии идет понижение концентрации белка и осадителя.
Очень важна скорость образования зародышей кристаллов, которая зависит от концентрации белка, а чем меньше кристаллов, тем больше их размер. Скорость же роста кристаллов зависит от растворимости белка, т.е. от концентрации растворителя. Иногда чтобы вырастить большие кристаллы, в раствор белка вносят затравку – мелкие кристаллы этого белка.
Кристалл белка может храниться полгода в специальном растворе, который не содержит белка. Подбирается такая концентрация осадителя, при которой кристалл не растворялся бы и не трескался. Кроме того, в раствор добавляют азид натрия или толуол против бактериального заражения.