Исследование свойств, механизма действия и специфичности, а также механизмов регуляции биосинтеза ферментов нуклеинового обмена (ДНКазы, РНКазы, фосфатазы) морских организмов с целью выяснения их биологической функции, а также возможности их использования в генетической инженерии, биотехнологии и медицине.

Исследование первичной структуры уникальных ферментов и белков, в том числе гликопротеинов- лектинов из морских беспозвоночных и микроорганизмов, и получение рекомбинантных белков на базе технологий рекомбинантных ДНК с привлечением последних достижений генной инженерии осуществляя полный цикл работ: от выбора стратегии клонирования индивидуального гена и его химико-ферментативного синтеза до разработки методов выделения, очистки и тестирования целевого белка. Основные усилия сосредоточены на использовании прокариотических штаммов-продуцентов. 

Основные результаты: 

Результаты проведенных исследований показали, что морские гидробионты и микроорганизмы являются перспективнейшими источниками новых высокоспецифичных нуклеаз и фосфатаз. Так, Ca²⁺,Mg²⁺-зависимые ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius и гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes kamchatica существенно различаются рядом свойств и выраженной специфичностью ко вторичной структуре субстратов в сравнении с металлозависимыми ДНКазами млекопитающих, в частности, панкреатической ДНКазой. Ca²⁺,Mg²⁺-зависимые ДНКазы морского происхождения преимущественно расщепляют двуцепочечные ДНК и полидезоксинуклеотиды, тогда как одноцепочечные субстраты абсолютно устойчивы к их действию. 

Способность Ca²⁺,Mg²⁺-зависимой ДНКазы из гепатопанкреаса краба камчатского преимущественно расщеплять совершенные дуплексы ДНК и не гидролизовать несовершенные дуплексами с замещением даже одного нуклеотида, позволила создать новый метод выявления однонуклеотидных замещений при анализе генов (SNP). Надежность и простота разработанного метода скрининга однонуклеотидных замен в геномной ДНК (SNP) позволяет исследовать молекулярную природу предрасположенности к различным заболеваниям. 

Практический интерес представляют кислые ДНКазы из яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius и печени минтая, способные изменять свою специфичность в зависимости от pH и ионной силы. 

Показано, что морские бактерии родов Alteromonas и Pseudomonas, выделенные из морской воды, донных осадков и некоторых видов асцидий, продуцируют РНКазы, проявляющие уникальную специфичность к природе азотистых оснований РНК. В частности, фермент, предпочтительно расщепляющий полиуридиловую кислоту, был выделен из штамма Alteromonas haloplanktis KMM 223 — представителя глубоководных свободно живущих морских бактерий. 

Из морских бактерий выделены новые щелочные фосфатазы, отличающихся необычайно высокой удельной активностью в сравнении с известными в настоящее время фосфатазами.Так, для щелочной фосфатазы Cobetia marina KMM 296 она составляла 15000 единиц на миллиграмм белка. Показано, что этот фермент может быть использован для структурных исследований нуклеиновых кислот, а также для препаративного получения конъюгатов с антителами. Впервые методами молекулярного клонирования и секвенирования хромосомной ДНК установлена первичная структура предшественника высокоактивной щелочной фосфатазы морской протеобактерии рода Cobetia. Показано, что белковая цепь щелочной фосфатазы Cobetia marina состоит из 535 аминокислотных остатков с лидерным пептидом, состоящим из 34 аминокислот. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности ЩФ Сobetia marina с известными ЩФ показал, что фермент имеет несколько существенных аминокислотных замен в области активного центра, а именно в сайте связывания ионов Mg2+, традиционно значимых для проявления активности всех ЩФ. Этот факт, а также наличие необычной петли в ближайшем окружении активного центра объясняет уникально высокую удельную активность и некоторые другие необычные физико-химические свойства морской щелочной фосфатазы. 

Совместно с лабораторией химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН установлена первичная структура эндо-1,3-бета-D-глюканаз двустворчатых моллюсков Spisula sachalinensis, Chlamys albidus и Patinopecten yessoensis, исследована зависимость между структурной организацией и каталитической активностью эндо-1,3-бета-D-глюканаз двустворчатых моллюсков, проводятся исследования возможности получения ферментативно активных рекомбинантных белков с целью установления функциональной роли аминокислотных остатков в каталитическом процессе и использования рекомбинантных эндо-1,3- бета-D-глюканаз двустворчатых моллюсков в биотехнологическом производстве 1,3;1,6-бета D-глюканов, обладающих иммуностимулирующим, антиопухолевым и радиопротекторным действием. 

Совместно с лабораторией химии ферментов установлена аминокислотная последовательность двух весьма перспективных для практического применения ферментов морских бактерий: α-N-ацетилгалактозаминидазы, выделенной из новой морской бактерии рода Arenibacter latericius KMM 426T, а также термолабильной α-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Показано, что α-N-ацетилгалактозаминидаза способна при рН 7,3 инактивировать групповую специфичность эритроцитов крови человека группы А, тогда как α-галактозидаза из морской бактерии способна инактивировать групповую специфичность B эритроцитов крови человека и прерывать адгезию патогенной бактерии Corinebacterium diphtheria к клеткам буккального эпителия. Построена теоретическая модель пространственной структуры и активного центра фермента с использованием в качестве прототипов α-галактозидазы из Termotoga maritima и Oriza sativa. С помощью модели установлено положение каталитических (кислотно/основного и нуклеофильного) остатков фермента. α-Галактозидаза классифицирована как представитель семейства GH36 клана-D. 

Разработан метод дифференциальной диагностики заболеваний человека, вызванных патогенными бактериями рода Yersinia, включая возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и других иерсиниозов, основанный на применении полимеразной цепной реакции. Метод отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять патогенные бактерии в биологических средах человека и животных при их количестве в пробе от 10-100 копий геномов. Разработанный метод может быть рекомендован для быстрой идентификации высоко патогенной чумной бактерии в случае использования последней террористами, а также для выявления этого возбудителя при контаминации объектов внешней среды. 

Совместно с лабораторией химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН методами генетической инженерии выделен и охарактеризован рекомбинантный маннан-связывающий лектин голотурии Apostichopus japonicus, на его основе разрабатывается высокоспецифичная тест-система ранней диагностики рака шейки матки. 

Впервые с помощью методов сайт-направленного мутагенеза сконструированы генетические конструкции, экспрессирующие мутантные формы основных мембранных белков-поринов патогенной для человека бактерии Yersinia pseudotuberculosis. Создана серия генно-инженерных конструкций гена OmpF порина, получены штаммы-продуценты. Подобраны условия выделения и рефолдинга рекомбинантного порина из телец включения. Показано, что рекомбинантный белок специфически взаимодействует с антителами, полученными при иммунизации кроликов природным порином. Рекомбинантный порин Y. pseudotuberculosis является потенциальным антигеном для диагностики и профилактики иерсиниозов.