Новая эндо-фуканаза для селективного получения антикоагулянтных олигосахаридов из бурых водорослей
Коллектив исследователей из ТИБОХ ДВО РАН представил результаты исследования функциональной характеристики нового фермента семейства гликозилгидролаз GH107 из морской бактерии Winogradskyella eximia KMM 3944. Работа демонстрирует возможность направленной ферментативной деполимеризации α-(1,3)-L-фукоиданов с сохранением заданных сульфатных паттернов, определяющих антикоагулянтную активность.
Фукоиданы ‒ сульфатированные полисахариды бурых водорослей ‒ рассматриваются как перспективные агенты для коррекции гемостаза, однако их клиническое применение ограничено высокой молекулярной массой, низкой биодоступностью при пероральном введении и неселективной активацией тромбоцитов. Решение этих проблем видится в получении низкомолекулярных производных фукомданов с контролируемой структурой. Для получения таких производных необходимы ферменты с узкой субстратной специфичностью.
В геноме W. eximia авторы идентифицировали кластер генов, ассоциированный с деградацией фукоиданов, включающий три гена предполагаемых эндо-фуканаз GH107 ‒ Wef1, Wef2 и Wef3. С помощью анализа сходства последовательностей и молекулярного докинга было предсказано, что Wef3 преимущественно связывает 2,4-дисульфатированные остатки L-фукозы (Fuc2,4S) в подсайтах −1 и +1, что указывает на способность гидролизовать α-(1,3)-гликозидные связи между такими остатками.
Рекомбинантная форма Wef3 проявила оптимальную активность при pH 6,0–7,1 и температуре 37 °C, не требуя присутствия двухвалентных катионов. Субстратная специфичность была верифицирована на панели фукоиданов различной структуры: Wef3 эффективно гидролизовал α-(1,3)-L-фукоиданы из Saccharina cichorioides (ScF) и Saccharina bongardiana (SbF), но не проявлял активности в отношении α-(1,3;1,4)-L-фукоиданов и галактофуканов. При этом фермент также расщеплял 2,3-дисульфатированный декасахарид с α-(1,3;1,4)-связями, что свидетельствует о каталитической промисскуитетности в отношении определенных олигосахаридных субстратов.
Продукты ферментативного гидролиза ScF и SbF были разделены на высокомолекулярные (HMP) и низкомолекулярные (LMP) фракции, а затем дополнительно очищены с помощью анионообменной хроматографии. ЯМР-спектроскопия выделенных олигосахаридов (включая трисахарид α-L-Fuc2,4S-(1,2)-α-L-Fuc4S-(1,3)-α-L-Fuc2,4S и гексасахарид с C2-разветвлением) позволила установить консенсусный сайт расщепления: Wef3 преимущественно гидролизует связи между остатками Fuc2R4S (R = H или SO₃⁻) в подсайтах −1 и +1, допуская также наличие C2-замещенных остатков в подсайтах −3 и +1.
Оценка антикоагулянтной активности в плазме крови человека (тесты АЧТВ, ТВ и ПВ) показала, что нативные фукоиданы и их HMP-производные демонстрируют дозозависимое удлинение времени свёртывания, сопоставимое с низкомолекулярным гепарином (клексаном). Наиболее выраженный эффект зафиксирован для SbF и HMP-SbF: удвоение АЧТВ достигалось при концентрациях 6,37 и 4,34 мкг/мл соответственно. LMP-SbF, обогащённый остатками Fuc2,4S (66% против 36% в LMP-ScF), сохранял умеренную активность (2АЧТВ = 19,01 мкг/мл), тогда как LMP-ScF с преобладанием 4-сульфатных фрагментов был практически неактивен. Это подтверждает, что 2,4-дисульфатирование является ключевым структурным детерминантом антикоагулянтного эффекта, при этом молекулярная масса также вносит значительный вклад, особенно в ТТ-тесте, зависящем от ингибирования тромбина через антитромбин III и гепарин-кофактор II.
В экспериментах на богатой тромбоцитами плазме выявлено, что высокомолекулярные фракции (нативные фукоиданы и HMP) индуцируют агрегацию тромбоцитов, причём активность коррелирует с молекулярной массой. Низкомолекулярный LMP-SbF, несмотря на сниженную массу (3,4 кДа), демонстрировал умеренный проагрегантный эффект благодаря высокой доле 2,4-дисульфатированных остатков. Все образцы подавляли АДФ- и ристоцетин-индуцированную агрегацию, причём ингибирование было более выраженным для нативных высокомолекулярных форм, что указывает на важность мультивалентных взаимодействий с рецепторами GPIbα и CLEC-2.
Полученные результаты позволяют заключить, что эндо-фуканаза Wef3 является первым представителем GH107 с подтверждённой селективностью к 2,4-дисульфатированным остаткам в α-(1,3)-связях, что открывает возможности для направленного получения олигосахаридных производных фукоиданов с заданным сульфатным профилем. Демонстрируемая зависимость биологической активности от источника сырья и условий ферментативной обработки подчёркивает необходимость комплексного подхода при разработке низкомолекулярных антикоагулянтов на основе фукоиданов. Данные исследования формируют основу для дальнейшего доклинического изучения полученных олигосахаридов в качестве пероральных антикоагулянтов с пониженным риском тромбоцитарной активации.
Результаты опубликованы в журнале International Journal of Biological Macromolecules.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 25-74-00085).